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Nature Communications | 季雄团队鉴定RNA聚合酶II转录工厂控制因子RUVBL2

日期: 2022-10-03

RNA聚合酶II(Pol II)作为真核细胞中转录核心机器,主要负责转录编码蛋白质的mRNA和部分非编码RNA。Pol II在细胞中并不是均匀分布的,而是在细胞核中形成大量聚集的簇(cluster),这些簇通常被称为转录工厂或者转录凝聚体。转录工厂是在1993年由Peter Cook 和Luitzen de Jong课题组在RNA聚合酶和新生RNA标记成像的实验中偶然发现 1,2,2012年Yijun Ruan 课题组通过RNA聚合酶的ChIA-PET测序分析进一步确认 32013年Xavier Darzacq 和 Ibrahim I. Cissé课题组通过超高分辨显微成像发现转录工厂呈现动态变化并且与活细胞中的RNA生成相关4。先前的研究发现转录工厂能够介导不同染色质位点基因的协同表达、增强基因转录效率、组织三维染色质结构、并且可以帮助癌症中的染色体易位。转录工厂相关研究的重要问题之一是并不清楚其关键控制因子。另一方面,基因表达调控的机制研究通常着眼于转录的起始、延伸和终止的过程研究,对于是否能够通过控制转录工厂实现基因表达操控依然未知。

2022年9月28日,Nature Communications在线发表了来自北京大学季雄课题组题为“The transcriptional coactivator RUVBL2 regulates Pol II clustering with diverse transcription factors”的研究论文。研究者通过多种质谱筛选鉴定和多学科技术证实AAA+家族ATPase分子RUVBL2能够直接控制活跃启动子附近的Pol II 转录工厂。RUVBL2在多种癌症中高表达,与癌症发生相关,是癌症抑制剂的热门靶点之一。该研究进一步鉴定出RUVBL2-Pol II 通路的直接调控基因,其中包括c-Myc等。相关工作为理解Pol II转录工厂提供新型因子,并且也为抗肿瘤靶点应用提供新的思路。

Pol II转录凝聚体调控因子的鉴定。为寻找鉴定转录Pol II凝聚体调控蛋白,研究者首先通过分析转录机器相关因子的染色质蛋白质组数据,并结合组蛋白修饰互作蛋白质组数据,筛选发现AAA+家族ATPase 分子RUVBL2能够与染色质上的Pol II 紧密互作。RUVBL2在前人的研究中发现其主要参与生物大分子复合体的组装,能够发挥类似于分子伴侣的功能,因此可作为Pol II凝聚体的潜在调控蛋白。研究者进一步捕获了RUVBL2的染色质结合位点信息,分析后发现该蛋白主要与Pol II共定位在基因的活跃启动子。通过特异性Pol II-CTD降解细胞系及体外纯化蛋白的Pulldown实验证明RUVBL2与非磷酸化的Pol II-CTD直接互作。在细胞中快速降解RUVBL2蛋白后,细胞核内Pol II 凝聚体数量明显下降,新生RNA测序表明细胞总体转录水平也明显下降,说明RUVBL2与Pol II凝聚体及基因转录活性密切相关。

RUVBL2分子调控Pol II凝聚体的机制。为确证RUVBL2对转录起始凝聚体的调控,研究者在RUVBL2蛋白降解前后对Pol II及转录起始因子TBP分别进行了活细胞时间序列光激活定位显微镜(tcPALM)及受激发射耗损(STED)显微镜成像观察,发现RUVBL2蛋白的降解可明显减少瞬时和稳定Pol II的凝聚体,转录起始因子TBP的凝聚能力也明显下降。另一方面,将RUVBL2蛋白募集到Lac O启动子区,在基因被激活的状态下可增强该启动子区域Pol II 凝聚体的形成;反之,Pol II-CTD的募集也会导致RUVBL2的汇聚,说明在细胞内RUVBL2能够促进Pol II的凝聚体的形成。为深入探索其机制,研究者通过细胞内定点募集、体外微滴实验及功能区域截短分析等,发现RUVBL2与其同家族蛋白RUVBL1的寡聚能力及ATPase活性对Pol II凝聚体的形成均具有关键贡献;体外微滴和DNA窗帘实验均证实生理浓度范围的RUVBL1/2异六聚体可显著促进Pol II-CTD及转录因子的相分离形成,体外转录实验证明RUVBL1/2可明显增强经典TATA启动子的转录起始,表明RUVBL2能够直接促进Pol II-CTD与转录因子的动态互作,增强转录起始活性。

RUVBL2-Pol II轴的功能。RUVBL2在多种肿瘤细胞中高表达,参与复合体众多,但RUVBL2的直接靶基因以及基因调控网络并不清楚。为探究RUVBL2促进Pol II凝聚体形成的功能,研究者应用吲哚乙酸介导的快速降解RUVBL2蛋白系统,并对RUVBL2降解后引起的基因转录和转录后效应进行分析。通过整合分析染色质免疫共沉淀测序(ChIP-Seq)、时间序列的转录组测序(RNA-Seq)以及新生转录组测序(PRO-Seq)数据,鉴定出45个在转录水平上快速响应RUVBL2降解的直接靶基因和41个在转录后水平快速响应RUVBL2降解的即时响应基因。进一步通过鉴定多种肿瘤细胞系中RUVBL2的染色质结合位点,证明了RUVBL2调控的45个靶基因在不同细胞系中的普适性,绘制了以RUVBL2-Pol II为轴的转录调控网络。应用机器学习对现有染色质结合数据进行综合分析,发现RUVBL2更广泛的与多种转录因子共结合在活跃基因启动子区域,可能共同调控基因表达,进一步提示了RUVBL2通过促进Pol II与多种转录因子形成转录凝聚体的模式发挥转录调控的功能。为此,研究者通过RNA原位杂交结合免疫荧光实验(smRNA FISH + IF)在RUVBL2直接靶基因位点也佐证了该模型。

RUVBL1/2基因表达调控模型

作为分子伴侣,RUVBL1/2参与复合体众多,包括RNA聚合酶的组装,染色质调控和转录后RNA加工相关复合体等,先前研究表明,RUVBL1/2在细胞核中主要与特定转录因子相互作用发挥转录共激活或抑制的功能(灰色箭头)。本研究主要发现证明了RUVBL1/2通过直接与Pol II CTD互作促进活跃启动子附近Pol II转录凝聚体的形成,从而发挥增强转录活性的功能(蓝色箭头),多种转录因子共同参与了该生物学过程。

总之,研究者发现RUVBL1/2对Pol II转录凝聚体的直接调控功能,鉴定RUVBL2-Pol II轴快速应答基因,促进了Pol II、转录因子互作与转录相分离调控机制关系的更深入理解;同时,RUVBL2在众多肿瘤细胞中表达异常,多种抑制剂均具有较好的抗肿瘤效果,本研究将为RUVBL2在肿瘤中调控基因表达的机制及其作为靶点应用提供新的思路。

北京大学新葡亰8814网站是多少季雄研究员为本论文通讯作者。北京大学新葡亰8814网站是多少王辉博士、李伯源博士为本论文共同第一作者。北京大学生物医学前沿创新中心邓伍兰研究员、定量生物学中心齐志研究员,清华大学高军涛研究员、复旦大学徐彦辉教授、中科院生物物理所俞洋和刘超培研究员等为该工作提供了重要帮助。该工作得到科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、北大-清华生命科学联合中心和细胞增殖与分化教育部重点实验室的资助。感谢北京大学凤凰工程多个仪器平台对本项目的大力支持。

季雄课题组长期从事RNA聚合酶亚基功能调控和疾病机理的研究。主要集中在RNA聚合酶相关的新型功能、脑部疾病和核酸适配体筛选等方向,近期成果发表在Molecular Cell、 Nature Communications、Genome Biology、Cell Discovery、CMLS和iScience等杂志上,为选择性基因表达调控提供新的假说。现因发展需要,诚邀博士后和研究生加入。

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-022-33433-3

参考文献:

1          Jackson, D. A., Hassan, A. B., Errington, R. J. & Cook, P. R. Visualization of Focal Sites of Transcription within Human Nuclei. Embo Journal 12, 1059-1065, doi:DOI 10.1002/j.1460-2075.1993.tb05747.x (1993).

2          Wansink, D. G. et al. Fluorescent Labeling of Nascent Rna Reveals Transcription by Rna Polymerase-Ii in Domains Scattered Throughout the Nucleus. Journal of Cell Biology 122, 283-293, doi:DOI 10.1083/jcb.122.2.283 (1993).

3          Li, G. et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation. Cell 148, 84-98, doi:10.1016/j.cell.2011.12.014 (2012).

4          Cisse, II et al. Real-time dynamics of RNA polymerase II clustering in live human cells. Science 341, 664-667, doi:10.1126/science.1239053 (2013).